"Assassin's Creed: Brotherhood" segue os eventos apresentados no segundo título da série, mostrando um Ezio mais maduro e tratado como mestre da sociedade secreta de assassinos que confronta a legião dos antigos templários.

O alvo agora é Roma, coração do inimigo, o que prova que a tarefa não vai ser nada fácil. Para isso, Ezio conta com a ajuda de outros assassinos, cada um com habilidades diferentes e influências específicas dentro da corte e também em meio à plebe como um todo.